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    核酸檢測實驗室(PCR)如何消毒?
    2020-07-30 [2173]

    摘要:PCR實驗,即臨床基因擴增實驗,是專門用來檢驗艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的一種檢測手段

     PCR實驗,即臨床基因擴增實驗,是專門用來檢驗艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的一種檢測手段。它可以通過將病毒體內所含的基因進行擴增的方法,測出一些病毒含量不高的感染者體內是否含有特定的病毒。

    而三級綜合醫院不具備核酸檢測能力的少之又少,大多已經實現了PCR實驗的基本要求,差別只在于開展項目略有不同,這項要求真正難以落實的主要問題是:二級醫院/縣醫院建立PCR實驗室不容易。

    就新冠病毒核酸檢測來說,RT-PCR是目前使用廣泛和較準確的篩選和確認方法,大規模核酸檢測,必然會引起相關機構單位著力建設規范的臨床PCR實驗室。但是,建立一個PCR實驗室,其實就是在建設一個平臺,考驗的不僅僅是一個醫療機構的實驗能力,也考驗著整個醫療機構的整體能力。下面,筆者就為大家整理一下PCR實驗室建設及日常管理方面的一些問題。

     

    一、臨床基因擴增檢驗實驗室設計的核心問題是什么?

    實驗室的平面布局、空調通風 系統設計、氣流控制等都是圍繞同一個核心問題進行——“避免污染”,任何級別的醫院在建設PCR實驗室時,均需要提前考量各個因素,以保證標本的全環節質量及實驗室的生物安全。

    1、建設要求。PCR實驗室的建設需要設置標準的“四區”:試劑準備區、標本制備區、PCR擴增檢測區和擴增產物檢測區。每個獨立實驗區設置有緩沖區,各區通過氣壓調節,使整個PCR實驗過程中試劑和標本免受氣溶膠的污染,并降低擴增產物對人員和環境的污染。

    2、人員要求。進入PCR實驗室,需要經過從基礎理論、實驗原理、規范操作、質量保證到注意事項等規范的培訓,并獲取PCR上崗證。

    3、檢測風險。檢測過程中,樣本的開蓋,核酸提取的震蕩、離心都有可能產生氣溶膠,有感染的風險。

    4、防護要求。必須按照生物安全三級實驗室的個人防護要求進行。

     

    二、PCR實驗的污染來源都有哪些?

    1、樣本間交叉污染:收集樣本的容器被污染或樣本密封不嚴導致外溢;不同樣本移液時忘記更換槍尖或未使用帶濾芯槍尖;移液器等實驗器具及耗材未及時消毒滅菌;不同樣本同時開蓋或樣本劇烈震蕩、反復吹吸導致氣溶膠形成擴散,相互交叉污染。

    2、實驗試劑污染:主要是在 PCR 組分試劑加樣過程中,由于移液器、容器、陰性對照及其它試劑被核酸模板或陽性對照污染。加樣過程中,因為PCR試劑對溫度十分敏感,需要通過冰浴使得PCR試劑和PCR板/管處于0℃,但這個過程也充滿污染風險。

    3、擴增產物污染:大量拷貝的產物泄漏或擴增后的PCR反應管意外開蓋,這是PCR反應中主要、常見的污染問題。因為PCR產物拷貝量大,遠遠高于PCR檢測數個拷貝的極限,所以極微量的PCR產物污染,就可形成假陽性。

    4、克隆質粒污染:作為陽性質控品的克隆質粒外溢。

     

    三、防止實驗污染都有哪些措施?

    對于低流行地區,PCR檢測人員經過嚴格培訓上崗后,核酸污染的風險相對較小,但在疫區超負荷工作時,就可能會遇到核酸污染的問題,可通過以下措施降低污染機會:

    1、正確佩戴手套:手套未緊密貼合拇指、食指和中指,在進行開蓋操作時容易發生交叉污染。

    2、正確使用生物安全柜:簡單、整潔、避免通風口堵塞;操作前后紫外線照射,消毒劑隨手可及;廢液缸里有1/3體積的含氯消毒液,并且及時清理廢液缸,保證廢物不超過廢液缸體積的2/3。

    3、核酸提取儀去污染:每天多批次檢測時,在每一批次檢測完以后必須用75%的乙醇和核酸去除劑對儀器進行去污染。

    4、重視通風:不定期對房間進行通風,每次至少持續30min。

    5、PCR擴增區去污染:PCR反應管必須蓋緊,避免擴增后的核酸對環境的污染。

    6、實驗室隨手可及的消毒劑。

     

    四、PCR實驗室的空氣流向管理與環境消毒?

    前面提到,PCR實驗室可分為試劑準備區、標本制備區、擴增區和產物檢測區四個區域,這四個區域在物理空間上必須完全相互獨立,各區域無論是在空間上還是在使用中,應當始終處于完全的分隔狀態,不能有空氣的直接相通。所以,臨床基因擴增檢驗實驗室的空氣流向應按:試劑準備區→標本制備區→擴增區→產物檢測區,應時刻防止擴增產物順空氣氣流進入擴增前區域??砂凑丈鲜鲰樞騾^域空氣壓力遞減的方式進行,也可通過安裝排風扇、負壓排風裝置或其他可行方式實現。

    臨床基因擴增檢驗實驗室的環境清潔:《臨床基因擴增實驗室工作規范》中有對物表清潔、消毒的要求,不同的實驗區域應當有其各自的清潔用具以防止交叉污染。

    (1)基本原則:由清潔區向污染區進行,潔具不可交叉。

    (2)清潔消毒方向:準備區→標本制備區→擴增區→產物檢測區。

    (3)清潔消毒范圍:工作區域的物體表面(含桌、椅),可使用含氯消毒劑擦拭消毒,空氣和工作臺面可使用紫外線照射消毒,也可使用空間消毒器進行全環節消毒。不可使用紫外線消毒器及化學消毒進行有人狀態下的消毒。PCR室內的消毒應防止揚塵(減少人員走動)、殺滅DNA或RNA的基因片段??蛇x擇懸掛紫外線燈管進行空氣消毒,試驗前照射30-60分鐘,實驗結束照射30-60分鐘,必要時延長照射時間(可照射一夜)。

    (4)終末消毒:當出現實驗室污染時,應按要求立即撤出相關人員,在無人情況下可使用化學消毒劑進行終末消毒,如熏蒸法:過氧乙酸1g/ m³加熱熏蒸(濕度70-90%),密閉24小時;氣溶膠噴霧:3%過氧化氫:20mL/m³氣溶膠噴霧;5%過氧乙酸2.5mL/m³氣溶膠噴霧(濕度20-40%)。

     

    五、日常清潔消毒應該如何做?

    1、每日工作前后,對工作區域表面、地面進行清潔并消毒,使用含氯消毒液擦拭。清潔采用濕式、不揚塵的方式進行。

    2、物品防塵存放。墻面定期清潔,有可見污染及時進行清潔消毒。配備移動紫外線消毒裝置進行空氣和物表的消毒。

    3、生物安全柜的消毒:

    (1)每天工作前:對生物安全柜的內表面進行消毒,包括工作臺面和內壁使用消毒劑擦拭;

    (2)工作結束:柜內物品全部消毒后移出。消毒劑擦拭臺面四周、以及玻璃內側燈部位;

    (3)停用生物安全柜前:運行5min以凈化內部空氣;

    (4)消毒劑應選擇能夠殺死生物安全柜里可能發生的任何微生物(70%乙醇、含氯消毒劑)。在使用漂白劑等腐蝕性消毒劑后,還應用無菌水再次進行擦拭;

    (5)終末消毒:需要進行終末消毒的時機。

     

    六、試驗完成后,物品及環境如何處理?

    (1)做好廢液及固廢處理;

    (2)實驗室空間消毒:在室溫,50-60%濕度條件下,使用過氧乙酸熏蒸2g/m³,過夜;或使用20g/l氣溶膠噴霧,用量8g/m³;

    (3)物體表面消毒液:0.55%含氯消毒劑,現用現配,24小時內使用。 

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